1 THUNDERBIRD® Probe One-Step qRT-PCR Kit

用途

Realtime RT-PCR

说明

本试剂盒是通过以高效率逆转录酶ReverTra Ace为逆转录酶和以Tth DNA Polymerase为PCR酶的两酶体系,进行一步法荧光定量PCR的试剂盒。主要使用TaqMan分析法进行荧光定量PCR。因为逆转录反应与PCR在同一反应体系中连续进行,反应液的分装操作一次就可以结束,适用于高通量分析。另外,样品间交叉污染的危险性也降低了。本产品中,两种酶与最优化过的buffer组分相组合,可以对微量RNA进行迅速定量。对RNA病毒及表达量低的mRNA的定量有利。另外,不易受目的基因序列的影响,可高灵敏度地检测出各种各样的RNA。 

特征

● 迅速・高灵敏度
通过使用Probe的One-step qRT-PCR,可迅速且高灵敏度地对微量RNA进行定量。

● 序列偏差的降低
不易受目的基因序列的影响,可高灵敏度地检测出各种各样的RNA。
将多重检测(Multiplex)时各目的基因扩增的偏差降至最低。

●混杂物抗性的提高
可避免因血红素等的PCR抑制剂导致的灵敏度下降。

●使用dUTP
通过添加Uracil-N-Glycosylase(UNG)*,能够防止因Carryover污染而导致的假阳性发生。

* 本产品中不含有UNG。

原来的一步法的缺点

本试剂盒的改良点

●引物的优化比较困难

【高灵敏度比较困难】

●容易产生因序列而导致的测定灵敏度偏差

●将因引物、探针或目的片段序列而引起的扩增偏差性影响抑制到了最小限度

→有利于各种各样的病毒及mRNA的迅速、高灵敏度检测或定量

●容易因RNA中的混杂物而引起灵敏度下降

●能够避免因混杂物引起的抑制

●用TaqMan probe法难于进行多荧光分析

●将多重检测中各目的片段扩增的偏差抑制到了最低限度

→最适于以管家基因作为对照的多数基因的相对定量等

实验例

1. 肠道病毒RNA的高灵敏度检测

将肠道病毒RNA作4倍稀释,使用TaqMan probe法,与其他公司的产品比较检测灵敏度及定量性。引物、TaqMan probe是直接使用论文记载的序列(没有进行优化处理)。用Applied Biosystems®、StepOnePlus进行分析。

2. 各种病毒检测灵敏度的比较

制备11种病毒RNA的4倍稀释系列溶液,使用TaqMan probe法,进行最高检测灵敏度的比较。引物、TaqMan probe是直接使用论文记载的序列。用Applied Biosystems®、StepOnePlus进行分析。

将各试剂能检测到的最低拷贝数连线作图。


结果显示:只有用本试剂盒时,才能对所有的目的基因以30个拷贝以下的灵敏度进行检测及定量。通过这个实验表明,本试剂不受目的片段序列的影响,能以高灵敏度检测到各种各样的RNA。

3. 多重荧光检测(Multiplex)体系中的表达定量

使用三种荧光标记的TaqMan探针,分别用单独检测及一次使用三种TaqMan探针的多重荧光检测体系,分析IL-1β、TNF-α、GAPDH基因的表达量。

实验中以HeLa S3 RNA(1pg~100ng的10倍稀释【6个梯度】)为样品,用Roche Diagnositics公司的LightCycler 96进行分析。

结果显示,各基因用单独(图1)及使用三通道的多重荧光检测(图2)分析中得到了相同的灵敏度,PCR效率及相关系数并没有太大的差异(表1)。

产品内容

【QRZ-101】
2× Reaction Buffer1.25ml ×2支
DNA Polymerase125μl
RT Enzyme Mix125μl
50× ROX reference dye100μl
2× Reaction Buffer1.25ml ×2支
(50μl体系100次,或20μl体系250次)


【QRZ-101S】
2× Reaction Buffer500μl
DNA Polymerase25μl
RT Enzyme Mix25μl
50× ROX reference dye*20μl
2× Reaction Buffer500μl
(50μl体系20次,或20μl体系50次)

*ROX溶液是另外添加的,可以对应几乎所有的荧光定量PCR检测仪器。

基本反应条件

RNase free waterXμl
2×Reaction Buffer25μl
DNA Polymerase1.25μl
RT Enzyme Mix1.25μl
Forward Primer25pmol
Reverse Primer25pmol
TaqMan® probe10pmol
RNA溶液Yμl
50× ROX Reference dye*11/0.1μl
(Uracil-N-Glycosylase1unit*2)

Total Volume50μl

*1 50×ROX reference dye,是对于使用 Passive Reference 的仪器(如Applied Biosystems 公司制造的仪器等),为校正各孔间的荧光强度及分注误差而使用。不用 Passive Reference 进行校正的仪器无需添加。

*2 使用Uracil-N-Glycosylase(UNG)处理时,请使用热敏性(heat-labile)UNG。可根据各公司推荐的条件,调整酶的用量。

Cycle
(20~25℃    10min.*3)
          ↓
50℃    10min.
          ↓
95℃    1min.
          ↓
95℃    15sec.
60℃    45sec. 40~45 cycles

*3 进行UNG处理时,请在逆转录反应前,设定UNG反应步骤。上述表示的是一般温度条件及反应时间,请根据各公司的推荐条件进行调整。

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