用途

定点突变导入（置换、缺失、插入）

说明

本品是利用KOD -Plus-高保真性，以Inverse PCR法进行位点特异性突变导入的试剂盒。本方法以质粒DNA为模板，使用反向设计的引物扩增质粒全长，进行突变导入。 

特征

●导入突变的多样性
在正常突变导入的基础上，可进行数10bp的插入(如Tag的插入)及数百bp的缺失突变。另外，也可通过导入不同的碱基突变来创建氨基酸的点突变文库。
●导入突变的可靠性
最大可得到95%的突变导入效率。另外，将PCR错配产生的2nd-site mutation(目的突变以外的突变)的可能性降到最低。已确认对最长11kb的质粒进行了突变导入。
●操作简便
转化之前只要3步的简单步骤。另外，无需准备磷酸化引物。

原理

实验例

1.缺失及插入突变时效率的比较
以7.3kb的质粒FLJ32066为对象，使用本产品与A公司的non-PCR法试剂盒，进行90个碱基的缺失及6×His对应的18个碱基的导入。结果显示：用其他公司的试剂盒难于进行的缺失及插入突变导入，使用本产品时可以高效率地获得突变体。

2. 目的外突变(2nd-site mutation)的插入频率评价
以试剂盒附带的对照质粒(4.3kb)为模板进行突变导入(以8循环进行PCR)，从得到的突变体中任意选取24个克隆，以2000bp长度分成几段分别进行测序。结果显示：使用本产品，在实际分析的总共48,000碱基中，只有一个目的以外的碱基发生突变。与A公司的non-PCR法试剂盒相比较，也是同等以上的效果。

产品内容

KOD -Plus-
10x Buffer for iPCR
2mM dNTPs
Dpn I
T4 Polynucleotide Kinase
Ligation high
Control Plasmid
Control Primer #1
Control Primer #2
活性的定义:
在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。
来源:
E.coli 重组体

注意事项

●本试剂盒中使用的酶与KOD -Plus-相同。

●10×Buffer for iPCR是进行了最优化的本试剂盒专用buffer。

*各酶溶液(KOD -Plus-, Dpn I, T4

 Polynucleotide Kinase)中，虽然含有属于消防法危险物品 第4类 着火性液体 第3石油类水溶性液体的50%的甘油，但是在着火点测定试验中已确认不属于危险物品。

基本反应条件

KOD-Plus-(1U/μl) 1μl

10×Buffer for iPCR 5μl

2mM dNTPs 5μl

Forward Primer 15pmoles

Reverse Primer 15pmoles

模板Plasmid　DNA 50ng

------------------------

Total Volume 50μl

Cycle

94℃, 2min.

    ↓

98℃ 10sec.

68℃ Xmin. 4〜10 Cycles