KOD-Fx

用途

PCR

说明

KOD FX是在KOD DNA polymerase基础上开发的高性能PCR试剂。
本酶具有出色的「扩增成功率」、「延伸性」和「扩增效率」,可对各种长度的目的片段进行PCR。
KOD FX是PCR成功率非常高,适合于各种实验条件的PCR酶。
实际测序结果表明,KOD FX在PCR过程中,产生碱基错配的频率(错配率)144535个碱基中仅为19个(保真性是Taq DNA polymerase的约11倍)。由此可见,KOD FX的保真性虽比KOD -Plus-、KOD -Plus-Ver.2和KOD -Plus- Neo要差一些,但仍可进行充分的克隆。通过本酶扩增的DNA片段的末端基本上都被平滑化。

特征

●高扩增成功率
对高GC含量的目的片段、细胞悬浊液、小鼠尾巴/植物裂解液、全血、霉菌、酵母等粗样品也可进行高成功率扩增。


●超群的扩增效率
由于得率很高,因此即便模板量很少也可进行扩增。

●出色的延伸性
已确认:以λDNA为模板可以扩增出40kb;以人类基因组DNA为模板可扩增出24kb;以cDNA为模板可扩增出13.5kb。


●通过热启动提高了PCR的反应效率
通过将2种抗KOD单克隆抗体预混合在酶中,抑制了PCR反应前常温状态下的多聚酶活性和3'→5' Exonuclease活性。抗体在PCR最初的变性步骤即发生失活,但对扩增反应没有任何影响。

注:Buffer A的配置方法请点击下载附件。

实验例

1. 碱裂解法制备的鼠尾裂解液的扩增例

向直接PCR反应液中添加碱裂解法(请参照右边的基本反应条件)制备的鼠尾裂解液0.5μl,以Mouse membrane glycoprotein(Thy-1)gene(M10246)为目的基因,用2步法循环,作30个循环的扩增。

结果显示,只有使用KOD FX时,才可以确认到明确的扩增。碱裂解法,相比使用Proteinase K的方法,操作简单,可以更加简便地分析转基因鼠的基因。

另外,扩增产物无须纯化,以下是用几种限制性内切酶消化处理的结果,可以确认扩增产物可被内切酶完全消化切断。

2. 一步法制备的植物裂解液的扩增例

向直接PCR反应液中添加一步法(请参照右边的基本反应条件)制备的番茄、烟叶、稻叶及精米裂解液1μl,以rbcL为目的基因,用2步法循环,作30个循环的扩增。

结果显示,只有使用KOD FX时,才可以确认到明确的扩增。通过将一步法与KOD FX组合,就可以简便地对植物基因进行分析。

3. 模板DNA量的探讨

使用KOD FX与其他公司的PCR酶,比较了模板DNA的量与扩增效率。

扩增反应中,以0.1ng~100ng的基因组DNA为模板,以human β-globin 2.8kb为目的基因,50μl反应体系,引物15pmoles,KOD FX使用了1U,按2步法,作了30个循环的扩增。

结果显示,相比其他公司的PCR酶,KOD FX可以得到更高的扩增效率。

产品内容

KOD FX(1U/μl)200μl×1支
2×PCR Buffer*[KFX-1B]1.7ml×3支
2mM dNTP**[NTP-201]1ml×2支
*含有终浓度2.0mM的Mg 2+ 
** 使用本酶进行PCR时,请使用dNTPs[NTP-201]。如果使用其他的dNTPs,有时可能得不到良好的扩增性能。
※50μl反应体系的情况下可使用200次。

组分:
50mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA
1mM DTT
0.001% Tween ® 20
0.001% Nonidet ® P-40
50% Glycerol

活性的定义:
在75℃活性测定条件下,在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。

来源:
E.coli 重组体

基本反应条件

灭菌蒸馏水X μl
2×PCR buffer for KOD FX25μl
2mM dNTPs10μl(0.4mM)
各引物15pmoles each
模板1~50ng(Plasmid)
10~200ng(Genome DNA)
~200ng[RNA相当](cDNA)
~2μl(粗样品)
〈一步法植物裂解液1μl〉
KOD FX (1U/μl)1μl(1U)

Total Volume50μl



〈2步法循环〉*
94℃ 2min.

98℃ 10sec.
68℃ 1min./kb 25~40 cycles

〈3步法循环〉*
94℃ 2min.

98℃ 10sec.
(Tm-5)℃ 30sec.
68℃ 1min./kb 25~40 cycles

〈Step down循环〉*
94℃, 2min.

98℃, 10sec.
74℃, 1min./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
72℃, 1min./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
70℃, 1min./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
68℃, 1min./kb 15~25 cycles

68℃, 7min.
*基本上以2步法循环进行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循环未见扩增时,请试一下3步法循环。另外,扩增10kb以上的目的片段时,如果出现Long PCR片段或非特异条带及弥散,请试一下Step down循环。

※Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具



<碱裂解法>
1) 将鼠尾(约3mm)放入离心管中。
2) 添加50mM NaOH 180μl。
3) Vortex充分振荡。
4) 95℃・10min.
5) 添加Tris-HC(l pH8.0) 20μl。
6) Vortex充分振荡。
7) 离心(12,000rpm, 10min.)
8) 取0.5~2μl上清进行PCR反应。
(鼠尾不会也无需完全溶解)

<一步法>
1) 将叶片(3mm)或精米(1粒) 放入离心管中。
2) 添加Buffer A* 100μl。
3) Vortex充分振荡。
4) 95℃・10min.
5) Vortex充分振荡。
6) 离心(12,000rpm, 10min.)
7) 取1μl上清进行PCR反应。
(植物组织不会也无需完全溶解)
*Buffer A:
 100mM Tris-HC(l pH9.5)
 1M KCl
 10mM EDTA

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